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microRNA研究进展及其在动物分子育种中的应用

在整个基因组中,编码蛋白的基因通常只占到2%左右,绝大多数的基因是不直接编码蛋白质的,但是参与生命活动的DNA 都被转录成RNA,还有大量的非编码RNA 的信息没有被揭开“面纱”。RNA 转录组学中microRNA 的研究,从首个microRNA: lin-4 的发现,到大规模microRNA 转录组的测定,再到目前microRNA 通过基因沉默方式调节靶基因表达的机制研究,一共经了三个阶段,尤其是大规模转录组测序后,大量的microRNA 被发现,与之相关的功能性研究正如火如荼的展开。多年来一直被认为是基因组中垃圾成分的非编码RNA 终于越来越得到人们的重视。研究发现,microRNA 对基因表达和生长发育起到了重要的调节功能。近年来,microRNA 参与动物表型调控的报道相继出现。2009 年,发现了果蝇的miR-8 基因在调节果蝇体型方面有重要作用,对miR-8 进行敲除实验发现果蝇体型明显变小,这说明microRNA 通过改变mRNA 的翻译水平能够显著的影响动物的表型。

1 microRNA 简介 1.1 microRNA 的发现

早在1993 年,Lee 等利用遗传分析方法发现了第一个microRNA: lin-4,它是线虫中的一个长度为22 nt的小分子非编码RNA。这种单链通过碱基配对的方式结合到靶mRNAlin-14 的3'末端非翻译区( 3'-untranslational region,3 ' UTR) ,从而抑制lin-14 的翻译,但并不影响其转录。7 年以后,另一个促进线虫幼虫向成虫转变的基因let-7被发现,它的转录产物是长度为21nt 的RNA 分子,作用方式与lin-14 相似,结合在lin-47和lin-57 的3'UTR 来抑制基因的翻译。到目前为止,已经在模式生物中发现了大量miRNA,当然

miRNA的数量远远不止这些,还有更多的miRNA尚未发现。 1.2 microRNA 的产生过程

microRNA( miRNA,miR) 是由约21 ~ 25 个核苷酸组成的分子,通过抑制mRNA 的翻译或者促进其降解而起到负性调控的作用。目前动物细胞中的miRNA多是短序列的非编码蛋白质RNA,不仅在基因位置上保守,并且还具有很高的序列保守性。动物miRNA成熟需要经历两个过程: 在前期长度大约为300 ~ 1 000个碱基的pri-microRNA( miRNA复合体) 先被加工成具有发夹结构的约70 ~ 90 个碱基大小的单链RNA前体

( pre-miRNA) ,然后pre-miRNA在Dicer 酶、ATP 和解旋酶的共同作用下分裂成21 ~ 25bp 的成熟miRNA。 1.3 microRNA的特点

①一般为22nt左右,其3′端允许有1~2nt长度的变化,如存在于拟南芥中26nt的一类RNA也属于miRNA;

②广泛存在于几乎所有的真核生物中,本身不具备开放阅读框(open read frame ORF),不能够编码蛋白质;

③成熟的miRNA5′端为单一磷酸基团,3′端为羟基,它们可以通过不完全互补配对与上游或下游的序列形成茎环结构;

④miRNA基因不是随机排列的,其中一些基因成簇排列且常常协同表达; ⑤miRNA具有保守性,鼠和人类中已知的miRNA有

53%与红鳍东方鲀(河豚)或斑马鱼同源,约12%的miRNA在线虫、果蝇和植物中表现出保守性;

⑥大多数miRNA的表达具有特异性和时序性,在不同的组织中miRNA的表达水平和类型不同,随着机体发育阶段的不同miRNA的表达也发生变化。如miR-3~miR-7在果蝇早期胚胎形成时特异表达,但在其他阶段未检测到表达;miR-212、miR-21和miR-22在幼虫阶

段表达量升高,并在成虫阶段维持较高水平。 1.4 microRNA 的生物学功能

成熟的miRNA通过与靶基因的特异结合调控基因的表达,这种调控作用机制有两种: ①在形成成熟的miRNA后,其结合到靶基因的3'UTRs( 3'端非翻译区) 来抑制靶基因的翻译过程,从而起到调控的作用。

②它能够像siRNA一样通过碱基互补配对结合到靶基因上,降解掉靶基因序列,以此来对靶基因进行调节。但在哺乳动物中,细胞内还没有发现内源siRNA,外源siRNA所介导的RNAi的抑制作用是一种抵御机制,而miRNAs恰恰在哺乳动物细胞内扮演了siRNA的角色。miRNA与siRNA不仅功能相似,并且从二者的加工过程来看,在前体的加工过程中都依赖相同的Dicer 酶参与。这两种小分子从序列上到它们发挥作用的机制上都存在一定的相似

性,很难从本质上区分。所以,如何在实验中正确区分和鉴别siRNA和miRNA,这还需要进一步的研究。

miRNA作为一种特殊的表观遗传学修饰,成为当下研究的热点与重点。很多研究表明,miRNA参与了生物体的生长增殖、细胞周期进程、凋亡和衰老等生物学过程,并与多种疾病的发生紧密相关。成熟的miRNA能在细胞核和细胞质间穿梭,可直接作用于核内基因。该过程主要由输出蛋白1 调控。研究表明,miR-29b含有六核苷酸元素而能指导其核运输,证明miR-29b主要定位在细胞核。几个miRNA通过结合在一些特异基因的启动子区调控核内基因表达。这些研究说明miRNA能在细胞核内行使功能。一些miRNA在参与双向负反馈环循环调节转录因子的同时,其表达也受到miRNA调控转录因子的反向调控。miRNA-24 在造血干细胞分化过程中表达上调,抑制细胞周期进程,主要是通过直接与转录因子E2F2 mRNA的3'UTR碱基互补配对,下调其表达。同时,研究表明,在细

胞周期的特定阶段,miR-27a会抑制肿瘤抑制因子FBW7的表达,释放对其底物细胞周期蛋白E的负影响,从而促使G1期向S期转换。这些实验都说明miRNA作为一种新的调控因子,对细胞周期过程具有调控作用。miRNA也具有调控心肌细胞和骨骼肌的分化和增殖、视网膜发育、肾发展及红细胞和血管生成[等功能。但miRNA的多样性功能作用机制是研究的难点。

1.5 miRNA的形成及其调控机理

miRNA的编码基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等形式存在于基因组中,通常位于基因间或内含子区域,图1 为几种后生动物的miRNA及其前体。这些miRNA或前体先由miRNA的编码基因转录形成初级miRNA(Pri-miRNA),其长度通常大于100 bp(有时甚至有几百bp),且带有一个或多个茎环结构,经Drosha与DGCR8两种酶剪切后形成带发夹与茎环的miRNA前体结构(pre-miRNA),然后通过Exportin 5 酶将前体运送至核外,接着经Dicer1 酶和TABP2 酶作用剪去发夹环形成双链结构,之后双链解开。其中,一条链即成熟miRNA链,与靶mRNA 的3’非翻译区(UTRs)结合形成双链被称为沉默复合体(RISC);而另一条称为星号链。RISC 诱导靶mRNA 的降解或抑制其翻译成蛋白或两者兼而有之,从而在转录后水平下调靶基因表达,见图2。细胞中miRNA编码基因的拷贝数粗略估计为500,比mRNA 编码基因的拷贝数高。然而拷贝数因物种和细胞种类而异。研究发现,单链miRNA区域在形成成熟链时可生成一系列其他形式的序列,这些序列长度不同,且有着不同的3’及5’末端,被称为miRNA异构体(isomiRs)。检测表明,这些异构体为变异核酸或是3’端附加的非临时核酸序列,也可能同样具备调控功能。miRNA在生理调控方面有许多新奇的潜在价值。它们有着诸多靶标基因且可通过不同的分子途径影响生理进程。

在动物中,microRNA的合成大致可以分为在细胞核内和细胞质内两个阶段:①在细胞核内,首先编码转录microRNA的基因由多聚酶Ⅱ转录生成pri-microRNA,pri-microRNA被