液体配制及实验方法 - 下载本文

(一)液体配制

1. 完全培养基

DMEM+10?S+1%双抗+(1%HAPS液) 若放置时间长于2周 加1%谷氨酰胺

2. PBS

1000ml去离子水中溶解 8.0gNaCl、 0.2gKCl、2.89gNa2HPO4、0.26gNaH2PO4

3. 胰酶

用之前调节PH值至7.6

4. CaCl2

将0.165gCaCl2粉末溶于10ml去离子水中配制成50X的溶液

每5ml胶原酶中加入100μl CaCl2溶液(终浓度3μmol/L) 用于激活胶原酶的活性

5. 双抗

终浓度:青霉素 100万U/100ml 链霉素 100万U/100ml 青霉素 0.6μg为1个单位 链霉素 1.2195μg为一个单位 称取青、链霉素粉末各0.6、1.2195g溶于10mlPBS中 再定容至100ml

6. 两性霉素B

100mg两性霉素B粉末溶于40mlPBS中,制成浓度为2.5mg/ml(1000X)的浓缩液 每100ml完全培养基中加入100μl 浓缩液,稀释为终浓度2.5μg/ml

7. 细胞冻存液

20%DMSO+80?S(1mlDMSO+4mlFBS)

8 STZ溶液

STZ溶于柠檬酸和柠檬酸三钠的盐溶液中

称取柠檬酸0.105g溶于5mlPBS 称取柠檬酸三钠0.145g溶于5mlPBS中 混合两者制成10毫升的溶解液. 再将100mgSTZ粉末溶于该溶解液中 制成浓度1%的STZ溶液,调节PH值至4.5,4°避光保存,由于STZ水溶性不稳定,溶液最好在半小时内使用完毕.

9 油红O

原液:油红 O 0.6g溶于异丙醇( 99% ) 100ml 。

稀释液:油红 O 原液 20ml ,蒸馏水 20ml ,过滤后使用。

10 茜素红

称取0.1g茜素红粉溶于100mlPBS,调节PH值到7.2,过滤后使用.

11 成骨诱导液

配方:DMEM(H)+10?S+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+0.1μmol/L地塞米松+50mg/LVitC

1)β-甘油磷酸钠分子量:216 溶于水

10mmol/L=216mg/100ml

称取216mgβ-甘油磷酸钠粉末溶于100ml低糖完全培养基中

2)地塞米松分子量:392.5 在无水乙醇中的溶解度为1mg/ml. 0.1μmol/L=0.04mg/L 将100mg地塞米松溶于100ml无水乙醇中 制成25000X的浓缩液 每100ml低糖完全培养基中加入4μl地塞米松浓缩液

3)VitC分子量176.1 溶于水

称取5mgVitC粉末溶于100ml低糖完全培养基中

12 成脂诱导液

配方:DMEM(L)+10?S+10μmol/L地塞米松+200μmol/L吲哚美辛+0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)+10mg/L胰岛素

1) 每100ml高糖完全培养基中400μl地塞米松浓缩液

2)吲哚美辛分子量:357.79 在无水乙醇中的溶解度为1g/50ml PH 7.4以下 0.2mmol/L=7.16mg/100ml

称取720mg吲哚美辛粉末溶于50ml无水乙醇 制成200X的浓缩液 每100ml高糖完全培养基中加入500μl吲哚美辛浓缩液

3)IBMX分子量:222.25 在DMSO中的溶解度为1M(222.25mg/ml) 0.5mmol/L=1.1mg/100ml

将100mgIBMX粉末溶于1mlDMSO 制成100mg/ml(9100X)浓缩液 每100ml高糖完全培养基中加入11μlIBMX浓缩液

4)Insulin浓缩液浓度为10mg/ml(1000X)

每100ml高糖完全培养基中加入Insulin浓缩液100μl.

溶解粉末时均需先用少量液体溶解,再定容。

(二)细胞培养

1.骨髓基质干细胞(BMSC)、脂肪基质干细胞(ADSC)的原代培养 1)准备工作

所需液体:培养基,血清(FBS),胶原酶

消毒(器械、烧杯、滤纸、离心管等)(PBS,枪头,青瓶和塞子,5套器械+3~4个烧杯+滤纸,离心管50+15ml)

水浴锅调节温度至37°预热

配制BMSC清洗液 将PBS倒入50ml的烧杯中加2%双抗和200ul两性霉素

配制ADSC清洗液 由于脂肪组织易污染,故将清洗液装入青瓶中,每100mlPBS加2%双抗和20~40ul两性霉素

配制骨髓冲洗液(PBS+3?S)即300ul血清

BMSC冲洗液及胶原酶可放入37度水浴锅或温箱中预热 2) 取组织

将SD大鼠(4周 60-80g)引颈处死,用75%酒精浸泡5-10分钟

取大鼠内脏脂肪,取脂肪时剪开皮肤及剪取脂肪分别用两套器械减少污染,将取好的腹部脂肪放入事先配制好的青瓶清洗液中

取大鼠长骨,尽量将附着的肌肉剔除干净,若骨头断裂髓腔暴露,污染可能性大,弃之。 将取出的脂肪及骨头分别在清洗液中清洗3-5次

3) 收集细胞

ADSC: 将清洗后的脂肪组织在广口小青瓶中剪碎,加入适量II型胶原酶(每1ml脂肪

组织加1ml胶原酶)以及CaCl2(200X),将混合物移至15ml离心管中37°C水浴30分钟(每间隔十分钟震荡15秒),30分钟后将混悬液用细胞筛网滤过,并用终止夜(10?S的PBS)2ml终止消化,收集液体至离心管,1500rpm离

心5-6分钟,弃上清重悬细胞,细胞计数并种入培养瓶中,加适量培养基,在培养瓶上标记动物种属、细胞类别、原代、日期.

BMSC:用器械剪去长骨两端,暴露骨髓腔,5ml注射器冲洗骨髓腔,收集液体至离心

管,1000rpm离心8分钟,弃上清重悬细胞,细胞计数并种入培养瓶中,加适量培养基,在培养瓶上标记动物种属、细胞类别、原代、日期.

2.换液

每2-3天一次,具体时间和频率根据细胞状态及培养基的颜色而定.

准备物品:PBS、试管吸管

步骤:吸出培养基,PBS清洗2遍,再加入培养基. 原代细胞首次换液时无需PBS清洗.

3.传代

原代细胞7天后传代,之后每2-7天传代,依据细胞密度及状态而定

传代时根据细胞密度选择所传的瓶数,一般1瓶90%融合的细胞可传2-4瓶.

准备物品:15ml离心管、试管吸管、培养瓶、PBS、培养基、胰酶(ph调至7.4-7.6) 步骤:1)吸出培养基,用PBS清洗2遍(应彻底清除培养基,否则血清会影响胰酶的消

化作用)

2) 加3-5ml(75cm规格培养瓶)胰酶至培养瓶中,放入37°C水浴锅或培养箱中消化2-3分钟,此过程中,显微镜下观察细胞形态由梭形变为圆形,立即加入3-5ml培养基终止消化.

3)用吸管轻柔吹打内壁数次帮助细胞脱落,也可用手轻拍瓶壁数下,将细胞悬液收集至离心管中,1000rpm离心6-8分钟 4)沿细胞沉淀方向缓慢倾倒液体,加1ml培养基重悬,将重悬液分配至各培养瓶中,再加入适量培养基,标记日期、代数.

4.冻存

准备物品:15ml离心管、试管吸管、冻存管、PBS、培养基、胰酶、冻存液、冰 步骤:1)将冻存液及培养基冰浴,保持低温,

2) 如传代步骤中的1-3将细胞离心后,加入冰浴的培养基500μl重悬,移至冻存管中

3)在冻存管中加入等量冻存液,约550μl(一滴一滴地加入),混匀 4)直接放入-80°C冰箱(梯度降温效果不理想),过夜转入液氮罐

5.复苏

准备物品:37°C水浴锅、15ml 离心管、培养瓶、培养基 步骤:1)预热水浴锅(37°C),在离心管中事先加入7-8ml培养基

2)将冻存的细胞在37°C水浴锅中迅速地摇晃,使其快速溶解

3)将1ml培养基加入冻存管中(一滴一滴地加入),混匀

4)将冻存管中混匀的细胞悬液加入有培养基的离心管中,1000rpm离心5分钟 5)弃上清,用1ml培养基重悬细胞,种入培养瓶,加适量培养基,标记

6.细胞计数

步骤:1)细胞悬液的制备同前

2)取细胞悬液15μl与等量0.08%胎盘蓝染液混合,将30μl混合液注入细胞计数板 3)数出四个象限(各16小格)的细胞总数后除以4,再乘以稀释倍数(一般细胞悬

液与染液是1:1混合,故乘以2),最后乘以104,即为细胞数量

7.流式细胞检测前的样品制备

准备物品:15ml离心管、1.5mlEP管、PBS、洗涤液(PBS+1?S) 步骤:1)将细胞消化、离心、去上清

2)用洗涤液洗涤一次,加1ml洗涤液重悬,将细胞悬液分装至数个EP管中(数量

依据上机管数而定) 3)继续用洗涤液将EP管中的细胞洗涤2遍,最后每管中加适量PBS重悬 4)将所需抗体与PBS进行1:1稀释,每EP管细胞悬液中加3-5μl相应抗体,保

留1管空白对照,4°C保存,待上机

8.流式细胞检测的抗体选择

设置同型对照,也可设置双标(FITC/PE) 1)CD29-FITC hamster IgG —— control 2)CD45-FITC mouse IgG1 ——— control

3)CD44-FITC mouse IgG2a —— control 4)CD34-FITC rabbit IgG —— control

9.细胞爬片的制备

准备物品:六孔板、盖玻片、离心管、PBS、胰酶、培养基 步骤:1)将第三代ADSC(数量约为2x104)制成细胞悬液1.8ml

2)将消毒好的盖玻片放入六孔板中,每孔取300μl细胞悬液平铺在盖玻片上 3)待细胞贴壁后(约30分钟),每孔加入约3ml 培养基

10.干细胞的诱导分化 1)成骨诱导:ADSC(P3-P5)制细胞爬片,待细胞70%融合后,将培养基换成成骨诱导液诱导,

每3天换液,共诱导21天,之后进行茜素红染色 2)成脂诱导: ADSC(P3-P5)制细胞爬片,待细胞70%融合后,将培养基换成成脂诱导液诱导,

每3天换液,诱导21天,之后进行油红O染色

11.染色方法 茜素红法

作用原理:利用沉积的钙于茜素红发生显色反应,得到红色的染色效果。 步骤:1) 吸去诱导液,再PBS洗一到两次;

2) 加入10%中性甲醛,固定30min-60min;

3) 吸去固定液,加入0.1%的茜素红染色液,染色6-10min; 4) 用PBS洗两次,去处残留的染色液;

结果:染料品种的不同,矿化结节呈现不同的红色。

油红O染色法

作用原理:细胞在胞浆中不断有油滴的累积,并不断的增加变大,利用Oil Red O的油溶性对油滴染色。

步骤:1) 吸去诱导液,再PBS洗一到两次;

2) 加入10%中性甲醛,固定60min;

3) 吸去固定液,加入现配和过滤后的Oil Red O染色液,染色60min; 4) 用PBS洗2-5次,去处残留的染色液和残渣

结果:分化的脂肪细胞呈红色

(三)动物模型的建立

免疫炎性1型糖尿病小鼠模型的建立采用小剂量多次STZ腹腔注射 Balb/c小鼠(6-8周,22-25g)、1%STZ、 40-60mg/Kg剂量连续五天注射 步骤:1)小鼠禁食过夜

2)次日清晨,甲紫溶液标记小鼠,测空腹血糖,称体重,计算所需药物剂量

3)配制1%STZ溶液(方法件上文)

4)1ml注射器抽取STZ对小鼠进行腹腔注射(注意注射器内因残留而损失的药物)

重复上述步骤共五天

在造模第三天进行第一次干细胞注射

步骤:1)制细胞悬液,每只小鼠1X106细胞

2)注射器抽取细胞悬液,用5或4.5头皮针对小鼠进行尾静脉注射,注射前75%酒

精消毒,注射后伤口涂红霉素软膏

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注意:小鼠尾静脉共4条,进针前绷直鼠尾,使静脉充盈,选择鼠尾下1/3处毛鳞片较薄

部位,两毛鳞片之间进针,如感觉无阻力,表明注射成功,若阻力较大或鼠尾皮下肿胀发白,表明未打入血管,则应重新注射。若第一次注射失败,小鼠尾静脉发生痉挛可用温水热敷鼠尾片刻使静脉重新扩张。每次进针应选择从远心端开始。

造模后7天再次测空腹血糖,检测造模是否成功,若未成模,加注STZ40mg/Kg1天

每周注射细胞,检测血糖、体重、进食量、饮水量.